微生物菌種及其制品的合適保藏方法

2017-04-19  來自: 鶴壁市百惠生物科技有限公司 瀏覽次數:564

在發酵工業中,具有良好性狀的生產菌種的獲得十分不容易,如何利用優良的微生物菌種保藏技術,使菌種經長期保藏后不但存活健在,而且保證高產突變株不改變表型和基因型,特別是不改變初級代謝產物和次級代謝產物生產的高產能力,即很少發生突變,這對于菌種極為重要。

      微生物菌種保藏技術很多,但原理基本一致,即采用低溫、干燥、缺氧、缺乏營養、添加保護劑或酸度中和劑等方法,挑選優良純種,最好是它們的休眠體,使微生物生長在代謝不活潑,生長受抑制的環境中。具體常用的方法有:蒸餾水懸浮或斜面傳代保藏;干燥-載體保藏或冷凍干燥保藏;超低溫或在液氮中冷凍保藏等方法。


      1.1. 蒸餾水懸浮法
      這是一種最簡單的菌種保藏方法,只要將菌種懸浮于無菌蒸餾水中,將容器封好口,于10℃保藏即可達到目的。好氣性細菌和酵母等可用此法保存。

      1.2. 斜面傳代保藏
      斜面傳代保藏方法是將菌種定期在新鮮瓊脂斜面培養基上、液體培養基中或穿刺培養,然后在低溫條件下保存。它可用于實驗室中各類微生物的保藏,此法簡單易行,且不要求任何特殊的設備。但此方法易發生培養基干枯、菌體自溶、基因突變、菌種退化、菌株污染等不良現象。因此要求最好在基本培養基上傳代,目的是能淘汰突變株,同時轉接菌量應保持較低水平。斜面培養物應在密閉容器中于5℃保藏,以防止培養基脫水并降低代謝活性。此方法一般不適宜作工業生產菌種的長期保藏,一般保存時間為3~6個月。如放線菌于4~6℃保存,每3個月移接一次;酵母菌于4~6℃保存,每4~6個月移接一次;霉菌于4~6℃保存,每6個月移接一次。


      1.3. 礦物油中浸沒保藏
      此方法簡便有效,可用于絲狀真菌、酵母、細菌和放線菌的保藏。特別對難于冷凍干燥的絲狀真菌和難以在固體培養基上形成孢子的擔子菌等的保藏更為有效。是將瓊脂斜面或液體培養物或穿刺培養物浸入礦物油中于室溫下或冰箱中保藏,操作要點是首先讓待保藏菌種在適宜的培養基上生長,然后注入經160℃干熱滅菌1~2h或濕熱滅菌后120℃烘去水分的礦物油,礦物油的用量以高出培養物1cm為宜,并以橡皮塞代替棉塞封口,這樣可使菌種保藏時間延長至1~2年。以液體石蠟作為保藏方法時,應對需保藏的菌株預先作試驗,因為某些菌株如酵母、霉菌、細菌等能利用石蠟為碳源,還有些菌株對液體石蠟保藏敏感。所有這些菌株都不能用液體石蠟保藏,為了預防不測,一般保藏菌株2~3年也應做一次存活試驗。

      1.4. 干燥-載體保藏
      此法適用于產孢子或芽孢的微生物的保藏。是將菌種接種于適當的載體上,如河砂、土壤、硅膠、濾紙及麩皮等,以保藏菌種。以沙土保藏用得較多,制備方法為:將河砂經24目過篩后用10%~20%鹽酸浸泡3~4h,以除去其中所含的有機物,用水漂洗至中性,烘干,然后裝入高度約1cm的河沙于小試管中,121℃間歇滅菌3次。用無菌吸管將孢子懸液滴入砂粒小管中,經真空干燥8h,于常溫或低溫下保藏均可,保存期為1~10年。土壤法以土壤代替砂粒,不需酸洗,經風干、粉碎,然后同法過篩、滅菌即可。一般細菌芽孢常用砂管保藏,霉菌的孢子多用麩皮管保藏。

      1.5. 冷凍保藏
      冷凍保藏是指將菌種于-20℃以下的溫度保藏。冷凍保藏為微生物菌種保藏非常有效的方法。通過冷凍,使微生物代謝活動停止。一般而言,冷凍溫度愈低,效果愈好。為了保藏的結果更加令人滿意,通常在培養物中加入一定的冷凍保護劑;同時還要認真掌握好冷凍速度和解凍速度。冷凍保藏的缺點是培養物運輸較困難。

      普通冷凍保藏技術(-20℃):將菌種培養在小的試管或培養瓶斜面上,待生長適度后,將試管或瓶口用橡膠塞嚴格封好,于冰箱的冷藏室中貯藏,或于溫度范圍在-5~20℃的普通冰箱中保存。或者將液體培養物或從瓊脂斜面培養物收獲的細胞分別接到試管或指管內,嚴格密封后,同上置于冰箱中保存。用此方法可以維持若干微生物的活力
      1~2年。應注意的是經過一次解凍的菌株培養物不宜再用來保藏。這一方法雖簡便易行,但不適宜多數微生物的長期保藏。
      超低溫冷凍保藏技術:要求長期保藏的微生物菌種,一般都應在-60℃以下的超低溫冷藏柜中進行保藏。超低溫冷凍保藏的一般方法是:先離心收獲對數生長中期至后期的微生物細胞,再用新鮮培養基重新懸浮所收獲的細胞,然后加入等體積的20%甘油或10%二甲亞砜冷凍保護劑,混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中,于-70℃超低溫冰箱中保藏。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在1~2℃/
      min。若干細菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏5年而活力不受影響。
      液氮冷凍保藏技術:近年來,大量有特殊意義和特征的高等動、植物細胞能夠在液氮中長期保藏,并發現在液氮中保藏的菌種的存活率遠比其他保藏方法高且回復突變的發生率極低。液氮保藏巳成為工業微生物菌種保藏的最好方法。具體方法是:把細胞懸浮于一定的分散劑中或是把在瓊脂培養基上培養好的菌種直接進行液體冷凍,然后移至液氮(-196℃)或其蒸汽相中(-l56℃)保藏。進行液氮冷凍保藏時應嚴格控制致冷速度。液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟是先制備冷凍保藏菌種的細胞懸液,分裝0.5~1ml入玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶,玻璃安瓿用酒精噴燈封口。然后以1.2℃/min的致冷速度降溫,直到溫度達到相對溫度之上幾度的細胞凍結點(通常為-30℃)。待細胞凍結后,將致冷速度降為1℃/min,直到溫度達到-50℃,將安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或氣相
      (-156℃)中保存。如果無控速冷凍機,則一般可用如下方法代替:將安瓿或液氮瓶置于-70℃冰箱中冷凍4h,然后迅速移入液氮罐中保存。在液氮冷凍保藏中,最常用的冷凍保護劑是二甲亞砜和甘油,最終使用濃度一般為甘油10%、二甲亞砜5%。所使用的甘油一般用高壓蒸汽滅菌,而二甲亞砜最好為過濾滅菌。


      1.6. 真空凍干保藏
      真空冷凍干燥的基本方法是先將菌種培養到最大穩定期后,一般培養放線菌和絲狀真菌約需7~10天,培養細菌約需24~28小時,培養酵母約需3天。然后混懸于含有保護劑的溶液中,保護劑常選用脫脂乳、蔗糖、動物血清、谷氨酸鈉等,菌液濃度為109~1019個/ml,取0.1~0.2ml菌懸液置于安瓿管中冷凍,再于減壓條件下使凍結的細胞懸液中的水分升華至1%~5%,使培養物干燥。最后將管口熔封,保存在常溫下或冰箱中。此法是微生物菌種長期保藏的最為有效的方法之一,大部分微生物菌種可以在凍干狀態下保藏10年之久而不喪失活力。而且經凍干后的菌株無需進行冷凍保藏,便于運輸。但操作過程復雜,并要求一定的設備條件。

      1.7. 寄主保藏
      適用于一些難于用常規方法保藏的動植物病原菌和病毒。

      1.8. 基因工程菌的保藏
      隨著基因工程的不斷發展,越來越多的基因工程菌需要得到合理的保藏,由于它們的載體質粒等所攜帶的外源DNA片段的遺傳性狀不太穩定、且其外源質粒復制子很容易丟失。另外,對于宿主細胞質粒基因通常為生長非必需,一般情況下當細胞丟失這些質粒時,生長速度會加快。而由質粒編碼的抗生素抗性在富集含此類質粒的細胞群體時極為有用。當培養基中加入抗生素時,抗生素提供了一有利于攜帶質粒的細胞群體的極有用的生長選擇壓。而且在運用基因工程菌進行發酵時,抗生素的加入可幫助維持質粒復制與染色體復制的協調。由此看來基因工程菌最好應保藏在含低濃度選擇劑的培養基中。例如,質粒pBR322。它除了能將外源DNA 輸入E.coli細胞外,還賦予E.coli細胞Ampr和Tetr。如果在培養基中加入Amp和Tet,則培養時可選擇出含pBR322質粒的細胞。

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