微生物肥料生物安全通用技術準則(NY 1109-2006)

2017-04-19  來自: 鶴壁市百惠生物科技有限公司 瀏覽次數:837

1 范圍
本標準規定了微生物肥料使用菌種安全性分級目錄、不同菌種及產品選擇毒理學試驗的原則、程序、試驗方法和結果評價方法。
本標準適用于中華人民共和國境內生產、銷售的微生物肥料。
2 規范性引用文件
下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件,其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內容)或修訂版均不適用于本標準,然而,鼓勵根據本標準達成協議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本適用于本標準。
GB 15193.3-2003   急性毒性試驗
GB/T 4789.28-2003  食品衛生微生物學檢驗染色法、培養基和試劑
3 術語和定義
下列術語和定義適用于本標準。
3.1 
半數致死量  median lethal dose,LD50
是經口給予受試物后,預期能夠引起動物死亡率為50%的單一受試物劑量,該劑量為經過統計得出的估計值。其單位是每千克體重所攝入受試物質的毫克數、克數或毫升數,即mg/kg體重、g/kg體重或mL/kg體重。
4 選擇毒理學試驗的原則
4.1 生產用菌種
微生物肥料生產用菌種分為四級管理,其安全分級目錄見附錄A。未列入附錄A中的菌種,除根瘤菌和乳桿菌(Lactobacillus)外,其余均需做毒理學試驗。
4.1.1  第一級(A.1)為免作毒理學試驗的菌種。
4.1.2  第二級(A.2)為需做急性毒性試驗的菌種。
4.1.3  第三級(A.3)為需做致病性試驗的菌種。
4.1.4  第四級(A.4)為禁用菌種。
4.2  產品
4.2.1  除有機物料腐熟劑以外的固體微生物接種劑類產品均免做毒理學試驗。
4.2.2  復合微生物肥料、生物有機肥和液體劑型微生物接種劑等需做急性毒性試驗。
5 毒理學試驗程序
5.1  菌種毒理學試驗程序
5.1.1  應提供微生物肥料生產用菌種的鑒定資料,包括屬及種的拉丁文學名和中文譯名、形態、生理生化特性及鑒定依據、功能評價等資料。
5.1.2  根據產品所含菌種的鑒定資料,依據附錄A之規定,確定菌種安全級別、是否做毒理學試驗及毒理學檢測項目。
5.1.3  對于需要做毒理學試驗的菌種,生產者需提供試驗用純菌種斜面,經復核確認與該菌種鑒定資料相符且無雜菌污染后,進行毒理學試驗。
5.2  產品毒理學程序
需對送檢產品進行菌種和載體物料的真實性確認后,進行毒理學試驗。
6 試驗方法
6.1 受試物的準備
6.1.1  菌種受試物
將試驗菌種接種于適宜的培養基中,在適宜的條件下培養一定時間,用生理鹽水調整菌液濃度至2.0×108~2.0×109cfu/mL,該溶液為菌種受試物。
6.1.2  產品受試物
固體產品根據試驗要求,配制所需濃度,溶劑首選去離子水,也可選用羧甲基纖維素、明膠、淀粉等。液體產品不可稀釋,直接使用。
6.2  急性毒性試驗
按GB 15193.3-2003執行。
6.3  致病性試驗
致病性試驗包括以下項目。
6.3.1  急性毒性試驗
方法同5.2。
6.3.2  一次破損皮膚刺激試驗
6.3.2.1  目的
檢測受試物對實驗動物皮膚的刺激/腐蝕作用和強度。
6.3.2.2  實驗動物
每次實驗至少需要3只皮膚完好的白色健康家兔或豚鼠。
6.3.2.3  操作程序
a)涂受試物前,將家兔或豚鼠背部脊柱兩側的毛去掉,去毛范圍約2.5cm×2.5cm,用75%酒精清潔、消毒暴露皮膚,待酒精揮發后,用滅菌刀片或注射針頭分別在兩塊皮區內劃一個“#”形的破損傷口。注意皮膚破損僅達表皮,不要傷及真皮。
b)將受試物0.5mL直接滴于破損皮膚上,或滴于同樣大小的2層~4層紗布上并敷貼于破損皮膚表面,然后用一層無刺激塑料膜或油紙覆蓋,再用無刺激膠布固定。另一側去毛破損皮膚作為空白對照(或溶劑對照),敷貼時間為4h。試驗結束后,用溫水或無刺激性溶劑除去殘留受試物。
c)分別于去除受試物后1h、24h和48h觀察皮膚局部反應,并按表1進行刺激反應評分。注意鑒別感染和原發性刺激反應的區別,若有感染可疑,應進行重復測試。
6.3.2.4  評價規定
在各個觀察時間點,按照表1對動物的皮膚紅斑與水腫形成情況進行評分,并按時間點將3只動物的評分相加,除以動物數,獲得不同時間點的皮膚刺激反應積分均值(刺激指數)。取其中最高皮膚刺激指數,按表2評定該受試物對動物皮膚刺激強度的級別。

 
表1  皮膚刺激反應的評分標準

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表2  皮膚刺激強度分級

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6.3.3  溶血試驗
6.3.3.1  目的
檢測受試物是否具有溶血特性。
6.3.3.2  操作程序
用無菌棉拭子蘸取菌種受試物, 以蛇形線接種于血瓊脂平板(按GB/T4789.28-2003中4.6規定),置36℃±1℃培養箱中培養, 24h后觀察有無溶血環產生。同時用已知陽性菌株金黃色葡萄球菌等作為對照。
6.3.3.3  試驗結果
    菌落周圍有溶血環的,則溶血試驗陽性;否則為陰性。
6.3.4  抗菌藥物敏感試驗
質控菌株可選用大腸桿菌ATCC25922等標準菌株。
6.3.4.1  目的
檢測受試物對抗生素的敏感性強度。
6.3.4.2  試驗用抗生素
可選用頭孢哌酮(CFP)、四環素(TE)、頭孢唑啉(CZ)、鏈霉素(S)、俐特靈(FR)、環丙沙星(CIP)、復方新諾明(SXT)、氯霉素(C)、氨芐青霉素(AM)、慶大霉素(GM)、強力霉素(DO)、丁胺卡那霉素(AN)、甲氟哌酸(PEF)、氟啶酸(ENO)、多西環素(DO)、依諾沙星(ENO)、阿米卡星(AN)等中的幾種。
6.3.4.3  操作程序
a) 用無菌棉拭子將受試物均勻涂抹于營養瓊脂平板表面,共涂抹3次。每涂抹1次,平板應轉動
60o,最后將棉拭子繞平板邊緣涂抹一周。蓋好平皿,置室溫干燥5min。
b)用無菌棉拭子蘸取濃度為2.0×108~2.0×109cfu/mL質控菌株菌懸液,均勻涂抹于營養瓊脂平板表面,具體方法同上,作為對照試驗。
c)以無菌操作取出抗生素紙片分別貼在涂有受試物和質控菌株菌懸液的平板培養基表面,每個平板放4個紙片。然后將平板置于36℃±1℃恒溫培養箱中培養18h后觀察抗生素紙片周圍有無抑菌環,量取并記錄其直徑(包括紙片直徑)大小,單位mm。試驗應做3個平行,取其均值。
d)質控菌抑菌環應均在質控范圍內,說明試驗方法準確可靠,否則試驗無效。
6.3.5  急性腹腔注射致病性試驗
6.3.5.1  目的
檢測受試物的急性致病性。
6.3.5.2  試驗動物
清潔級健康成年小鼠,體重18~20g。
6.3.5.3  操作程序
a)選健康成年小鼠40只,體重18~20g,雌、雄各半,劑量為500mg/kgBW,按0.1mL/10gBW經腹腔注射受試物。
b)于腹腔注射后第3d、7d分別取存活的實驗動物雌、雄各5只解剖,并做大體病理學觀察。
c)腹腔注射后第14d將剩余實驗動物處死、解剖并做大體病理學觀察。
6.3.5.4  結果觀察、評價
根據試驗周期內動物有無死亡及出現的中毒體癥、大體病理學觀察及病理組織學檢查發現病變的程度進行分級判定(見表3)。
表3 急性致病性判定標準

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6.3.6   急性眼刺激試驗
6.3.6 .1  目的
檢測受試物對實驗動物眼睛的急性刺激和腐蝕作用。
6.3.6.2  實驗動物
3只家兔,試驗前檢查家兔雙眼,有異常者不能用于試驗。
6.3.6.3  操作程序
a)吸取受試物0.1mL,滴入家兔一側眼結膜囊內,另一側眼以生理鹽水作為正常對照。
b)滴受試物后,將眼被動閉合4s,30s后用生理鹽水沖洗。于滴眼后1h、24h、48h、72h、7d、14d和21d,肉眼觀察家兔眼結膜、虹膜和角膜的損傷與恢復情況。如果72h內未出現刺激反應,或第7d或第14d,眼睛刺激反應完全恢復,即可提前終止試驗。必要時,用2%熒光素鈉溶液或裂隙燈、放大鏡檢查角膜及虹膜變化。
6.3.6.4  評價規定
按表4對家兔眼角膜、虹膜和結膜的急性刺激反應進行評分,并分別計算每只動物在三個不同觀察時間(24h、48h和72h)角膜損害、虹膜損害、結膜充血和結膜水腫四方面的“平均評分”(即每只動物的24h、48h和72h評分之和除以觀察數3)。分別以動物眼角膜、虹膜和結膜充血、水腫的平均評分和恢復時間進行評分,按表5或表6眼刺激反應分級標準判定受試物對眼睛的刺激強度。
表4  急性眼刺激反應的評分標準

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表5  眼刺激反應分級標準

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表6   眼刺激性反應分級標準

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7 結果評價
凡毒理學試驗結果評價為有毒的產品,不得生產和銷售;有毒或致病性試驗結果不符合的菌種,均不得作為微生物肥料生產用菌種。
7.1  急性毒性試驗
根據半數致死量(LD50)數值,判定受試物的毒性分級, 半數致死量(LD50)劑量分級按GB 15193.3-2003附錄D執行,凡LD50>5000mg/kgBW的,可通過,即該菌種可作為生產用菌種或該產品可進行生產、銷售。
7.2  致病性試驗
7.2.1 急性毒性試驗
結果判定同6.1。
7.2.2 一次破損皮膚刺激試驗
如結果為無刺激或僅具輕度刺激作用,可通過;否則,應放棄使用。
7.2.3 溶血試驗
溶血試驗結果為陰性的,可通過;否則,應放棄使用。
7.2.4 抗菌藥物敏感試驗
受試菌株必須對兩種以上的抗生素敏感;否則,應放棄使用。
7.2.5 急性腹腔注射致病性試驗
結果為無急性致病性可通過;否則,應放棄使用。
7.2.6 急性眼刺激試驗
結果對眼無刺激性或具有輕刺激性的,可通過;否則,應放棄使用。
 
附錄A
(規范性附錄)
菌種安全分級目錄
A.1  第一級:免作毒理學試驗的菌種
A.1.1  根瘤菌類                       
Azorhizobium caulinodans                           莖瘤固氮根瘤菌(田菁(莖瘤)根瘤菌)
Bradyrhizobium elkanii                               埃氏慢生根瘤菌(慢生大豆根瘤菌)
Bradyrhizobium japonicum                          日本慢生根瘤菌(慢生大豆根瘤菌)
Bradyrhizobium liaoningense                       遼寧慢生根瘤菌(慢生大豆根瘤菌)
Mesorhizobium huakuii                                  華癸中生根瘤菌(紫云英)
Mesorhizobium loti                                        百脈根中生根瘤菌
Rhizobium etli                                              埃特里根瘤菌(菜豆)
Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli       豌豆根瘤菌(菜豆生物型)
Rhizobium leguminosarum biovar trifolii         豌豆根瘤菌(三葉草生物型)
Rhizobium leguminosarum biovar viceae          豌豆根瘤菌(蠶豆生物型)
Sinorhizobium fredii                                   費氏中華根瘤菌(快生大豆根瘤菌)
Sinorhizobium meliloti                                苜蓿中華根瘤菌
還包括尚未確定種名的,從一些豆科植物根瘤內分離、純化、鑒定、回接、篩選后在原宿主植物結瘤、固氮良好的根瘤菌,如花生、綠豆、沙打旺根瘤菌等。
A.1.2  自生及聯合固氮微生物類         
Azospirillum lipoferum                                  生脂固氮螺菌
Azospirillum brasilense                                  巴西固氮螺菌
Azotobacter beijgerinckii                                拜氏固氮菌
Azotobacter chroococcum                               褐球(圓褐)固氮菌
Azotobacter vinelandii                                   棕色固氮菌
Azotobacter paspali                                       雀稗固氮菌
Beijerinckia indica                                        印度貝氏固氮菌
A.1.3  光合細菌類                     
Rhodobacter capsulatus                                  莢膜紅細菌
Rhodobacter sphaeroides                                類球紅細菌(球形紅桿菌)
Rhodopseudomonas acidophila                        嗜酸紅假單胞菌
Rhodopseudomonas gelatinosa                        膠質紅假單胞菌
Rhodopseudomonas globiformis                      球形紅假單胞菌
Rhodopseudomonas palustris                           沼澤紅假單胞菌
Rhodopseudomonas rutila                              血色紅假單胞菌
Rhodopseudomonas sulfidophila                     嗜硫紅假單胞菌
Rhodopseudomonas viridis                             綠色紅假單胞菌
Rhodospirillum fulvum                                  黃褐紅螺菌
Rhodospirillum rubrum                                  深紅紅螺菌
Rhodospirillum salinarium                             鹽場紅螺菌
Rubrivivax gelatinosus                                  膠狀紅環菌(膠狀紅長命菌)
A.1.4  分解磷鉀化合物細菌類           
Bacillus amyloliquefaciens                              液化淀粉芽孢桿菌
Bacillus laterosporus                                      側孢芽孢桿菌
Bacillus licheniformis                                    地衣芽孢桿菌
Bacillus megaterium                                      巨大芽孢桿菌
Bacillus mucilaginosus                                  膠胨樣芽孢桿菌
Bacillus subtilis                                            枯草芽孢桿菌
Bacillus thuringiensis                                     蘇云金芽孢桿菌
Thiobacillus thiooxidans                                氧化硫硫桿菌
A.1.5  促生細菌類                     
Paenibacillus azotofixans                               固氮類芽孢桿菌
Paenibacillus polymyxa                                 多粘類芽孢桿菌
A.1.6  酵母菌類                       
Candida guillermondii                                    季也蒙假絲酵母
Candida membranaefaciens                            膜醭假絲酵母
Candida tropicalis                                         熱帶假絲酵母
Candida utilis                                               產朊假絲酵母
Endomycopsis fibuliger                                  扣囊擬內孢霉
Pichia farinosa                                     粉狀畢赤酵母
Pichia membranaefaciens                               膜醭畢赤酵母
Saccharomyces cerevisiae                               釀酒酵母
Rhodotorula rubra                                        深紅酵母
A.1.7  放線菌類                       
Frankia sp.                                                  弗蘭氏克菌(固氮放線菌)
Streptomyces chingyangensis                          涇陽鏈霉菌
Streptomyces microflavus                                細黃鏈霉菌
A.1.8  AM真菌類                      
Glomus mosseae                                            摩西球囊霉
A.1.9  其它                           
Lactobacillus parabuchner                              類布氏乳桿菌
Lactobacillus acidophilus                               嗜酸乳桿菌
Lactobacillus bulgaricus                                 保加利亞乳桿菌
Lactobacillus casei                                         干酪乳桿菌
Lactobacillus delbruecki                                 德氏乳桿菌
Lactobacillus lactis                                        乳酸乳桿菌
Lactobacillus plantarum                                 植物乳桿菌
Pediococcus pentosaceus                                戊糖片球菌
Streptococcus lactis                                    乳酸鏈球菌
Streptococcus thermophilus                       嗜熱鏈球菌
A.2  第二級:需做急性毒性(LD50)試驗的菌種
Arthrobacter aurescens                                   金黃節桿菌
Aspergillus candidus Link                               亮白曲霉
Aspergillus niger                                            黑曲霉
Aspergillus oryzae                                          米曲霉
Aspergillus penicillioides Speg                        帚狀曲霉
Aspergillus wentii Wehmer                             溫特曲霉
Eurotium chevalieri Mangin                            謝瓦散囊菌
Bacillus brevis(Brevibacillus brevis)                短芽孢桿菌
Bacillus circulans                                          環狀芽孢桿菌
Bacillus coagulans                                        凝結芽孢桿菌
Bacillus pumilu                                             短小芽孢桿菌
Bacillus sphaericus                                        球形芽孢桿菌
Brevibacterium sp.                                         短桿菌
Burkholderia fungorum                                  真菌伯克霍爾德氏菌
Chaetomium  cochliodes                                 螺卷毛殼
Chaetomium trilaterale                             三側毛殼
Clostridium pasteurianum                          巴斯德梭菌
Geobacillus stearothermophilus                        嗜熱脂肪地芽孢桿菌
(Bacillus stearothermophilus)                         
Geotrichum candidum                                    白地霉
Nocardia sp.                                                 諾卡氏菌
Nocardiopsis sp.                                            擬諾卡氏菌
Paenibacillus macerans                                  浸麻類芽孢桿菌  
Penicillium citreonigrum                                黃暗青霉
Penicillium citrinum                                       桔青霉
Penicillium frenguentans                                常現青霉
Penicillium glabcum                                      光孢青霉
Pseudomonas fluorescens                                熒光假單胞菌
Promicromonospora citrea                              檸檬原小單胞菌
Pseudomonas putida                                      惡臭假單胞菌
Pseudomonas stutzeri                                     施氏假單胞菌
Pseudomonas vesicularis                                泡囊假單胞菌
Rhizopus oryzae                                             米根霉
Sphingobacterium multivorum                         多食鞘氨醇桿菌
Sporotrichum thermophile                               嗜熱側孢霉
Streptomyces albidoflavus                               微白黃鏈霉菌
Streptomyces fradiae                                      弗氏鏈霉菌
streptomyces griseospiralis                              灰旋鏈霉菌
Trichoderma harzianum                           哈茨木霉
Trichoderma koningii                                     康寧木霉
Trichoderma viride                                        綠色木霉
A.3  第三級:需做致病性試驗的菌種
Acinetobacter calcoaceticus                            乙酸鈣不動桿菌
Acinetobacter baumannii                                鮑氏不動桿菌
Alcaligenes denitrificans                                反硝化產堿菌
Alcaligenes faecalis                                       糞產堿菌
Alcaligenes xylosoxidans                                木糖氧化產堿菌
Bacillus cereus                                              蠟樣芽孢桿菌
Enterobacter agglomerans                              成團腸桿菌
Enterobacter cloacae                                     陰溝腸桿菌
Enterobacter gergoviae                                  日勾維腸桿菌
Pseudomonas alcaligenes                                產堿假單胞菌
Pseudomonas diminuta                                   缺陷假單胞菌
Proteus sp.                                                    變形菌
A.4  第四級:禁用菌種
Erwinia sp.                                                  歐文氏菌
Klebsiella pneumoniae                                   肺炎克雷伯氏菌
Klebsiella oxytoca                                         產酸克雷伯氏菌
Pseudomonas aeruginosa                               銅綠假單胞菌

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